ОПТИМІЗАЦІЯ МЕТОДУ ЕНЗИМ-ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ ДЛЯ ВИКОРИСТАННЯ ЯК СУБСТРАТ КОЛАГЕНУ

КАЛАШНІКОВА, М., САВЧУК, О., КАРБОВСЬКИЙ, В. (2023). OPTIMIZATION OF AN ENZYME ELECTROPHORESIS METHOD FOR USING COLLAGEN AS A SUBSTRATE. Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Біологія, 94(3). https://doi.org/10.17721/1728.2748.2023.94.41-45

Вступ.  Представлено оптимізований метод ензим-електрофорезу з використанням колагену як субстрат. Основними параметрами, що впливають на ефективність та роздільну здатність методу, є ступінь розведення проб, концентрація розподільчого гелю, концентрація розчину колагену, кополімеризованого в розподільчий гель та час продовження електрофоретичного розділення.
Методи. Для того, щоб дослідити всі активні та проактивні форми плазміну, усі зразки були приготовлені у двох варіаціях: з додатковою активацією, шляхом додавання стрептокінази (Ск), та без неї. Для отримання чітко видимих точок лізису зразки із Ск розводили у співвідношенні 1:16, а зразки без Ск розводили у співвідношенні 1:8. Для запобігання міграції субстрату та втрати електрофоретичної рухливості білків використовували розподільчий гель з концентрацією 15 %, а концентрація розчину колагену, кополімеризованого в гель, становила 1 мг/мл. Для отримання найбільш інформативних результатів час продовження електрофоретичного розділення становив 15 хв. Після електрофорезу гелі відмивали в 2,5 % розчині Тритон Х-100 протягом 1 год та фарбували відповідно до стандартного протоколу.
Результати. У результаті проведенних досліджень було знайдено оптимальні умови проведення модифікації ензим-електрофорезу згідно з усіма аналітичними маніпуляціями та показано методичні підходи до виявлення латентних проферментних форм ензимів, яким властива колагенолітична активність.
Висновки. Описану модифіковану методику можна використовувати для кількісного та якісного аналізу наявності колагенолітичної активності в різних зразках, що дозволяє проводити дослідження ферментів, яким властива така активність, як з наукових позицій, так і в процесі пошуку та розроблення технологій отримання ферментів-колагенолітиків для біотехнологічних цілей.