Дизайн та пошук потенційних інгібіторів ангіотензин перетворювального ферменту2 (АПФ2 - англ. ACE2)

Кравець І. О. Дизайн та пошук потенційних інгібіторів ангіотензин перетворювального ферменту2 (АПФ2 - англ. ACE2) : дис. ... доктора філософії : 102 Хімія. Київ, 2025. 192 с.

Кравець І.О. Дизайн та пошук потенційних інгібіторів ангіотензин перетворювального ферменту2 (АПФ2 - англ. ACE2). - Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 102 Хімія (10 – Природничі науки). - Інститут високих технологій Київського національного університету ім.Т.Шевченко, Київ, 2025.
Дисертаційна робота присвячена дизайну та пошуку потенційних інгібіторів ангіотензин-перетворювального ферменту2 (АПФ2).
У рамках роботи виконано такі завдання:
Ідентифіковано нові хемотипи серед структурно подібних аналогів відомих інгібіторів, що демонструють підтверджену селективну активність щодо АПФ2. Синтезовано та охарактеризовано молекули, з метою подальшої біологічної оцінки.
Оптимізовано низку відомих синтетичних шляхів та розроблено нові ефективні підходи до синтезу ключових сполук-зондів. Удосконалення процесів дозволило значно збільшити вихід цільових речовин (до десятків грамів), знизити витрати на реагенти та спростити апаратну реалізацію реакцій. Це стало можливим завдяки відмові від дорогих реагентів, впровадженню більш доступного лабораторного обладнання та загальній оптимізації умов синтезу.
Із літературно описаних інгібіторів АПФ2 два були синтезовані в необхідних кількостях за валідованими процедурами.
Три сполуки подано для реєстрації на міжнародному порталі Chemical Probe Portal (https://www.chemicalprobes.org/) в якості хімічних зондів — авторитетному ресурсі для верифікації молекулярних інструментів у біомедичних дослідженнях.
Адаптований біохімічний методу для скринінгу інгібіторів АПФ2, а саме наявний комерційний набір Abcam (ab273373), оптимізувавши об’єми реакційної суміші та концентрації ключових компонентів (ферменту, субстрату, інгібітора), що дозволило досягти надійного аналітичного сигналу навіть при зменшеному загальному об’ємі реакції (до 25 мкл).
Метод було валідувано шляхом визначення IC₅₀ для референтних інгібіторів (MLN-4760 та DX600) в нових умовах. Це забезпечило можливість проведення високопродуктивного скринінгу (HTS) для 577 відібраних in silico сполук з подальшою побудовою дозозалежних кривих для підтверджених активних хітів.
Розроблено і валідовано нові моделі докінгу для мішеней АПФ2 та АПФ. Отримані in silico моделі продемонстрували високу точність при прогнозуванні активності відомих лігандів, що дало змогу оцінити селективність взаємодії з ферментами АПФ2/АПФ (англ. ACE) для створення набору низькомолекулярних хімічних зондів для специфічного інгібування АПФ2.
Реалізовано високопродуктивний підхід до віртуального скринінгу з фокусом на хемотипове різноманіття. Завдяки цьому підходу було опрацьовано бібліотеки молекул обсягом до 1,4 млрд. сполук із високою ефективністю щодо часу обчислень і ресурсів.
Запропоновано оптимізовані протоколи, що забезпечують до десятикратного зменшення обчислювальних витрат за рахунок раціонального комбінування швидких попередніх фільтрів і більш точних розрахунків.
Проведено віртуальний скринінг Enamine In-Stock колекції із використанням трьох незалежно валідованих робочих процесів. Вибрані комплекси були додатково проаналізовані методами молекулярної динаміки для верифікації стабільності зв’язування.
На основі результатів комп’ютерного скринінгу було відібрано та протестовано 577 сполук із Enamine In-Stock колекції в експериментальному ферментативному аналізі з використанням флуоресцентного методу (HTS-формат). Для двох еталонних сполук ("Abcam" та EN300-22203532) визначено IC50 значення — 185 нМ і 0,9 нМ відповідно.
Виявлено 7 нових хітів, які продемонстрували рівень інгібування >30%. Для цих семи активних сполук побудовані криві залежності доза-відповідь (DRC), що підтвердило їхню біологічну релевантність. Одна зі сполук (Z1459912954) продемонструвала IC50 = 16,8 мкМ та була рекомендована для подальшої структурної оптимізації.
Після виявлення активних хітів було виконано віртуальне подальше моделювання для розробки активніших та селективніших аналогів.
Сформовано новий інтегрований робочий процес для комплексного вивчення особливостей сайту зв’язування з урахуванням методик FTMove, FTMap, а також залученням QSAR-моделювання з використанням алгоритмів машинного навчання.
Окрему увагу приділено пошуку потенційних цинк-зв'язувальних сполук, здатних до координації з іоном Zn2+ у каталітичному центрі мішені. Реалізовано окремий докінг-напрямок, орієнтований на виявлення таких лігандів з бажаними координаційними властивостями.
Сумарно в результаті виконаної роботи отримано 224 сполук-кандидатів, рекомендованих для подальшої біологічної валідації.
Наукова новизна отриманих результатів полягає в застосуванні цілісного поєднання сучасних комп’ютерних (in silico) та експериментальних підходів, що дозволили реалізувати системний підхід до ідентифікації та валідації нових селективних інгібіторів АПФ2. Уперше реалізовано багаторівневу стратегію пошуку молекулярних зондів, яка поєднує докінг, фармакофорне моделювання, кластерний аналіз хемотипів, QSAR-моделювання з алгоритмами глибокого навчання, молекулярну динаміку, а також широкий спектр методів експериментальної перевірки (HTS-ферментативні аналізи, побудова кривих доза-відповідь). Запропоновано нові підходи до аналізу координаційної взаємодії лігандів з катіоном цинку у структурі мішені. Розроблені in silico моделі демонструють високу прогностичну здатність щодо селективності та афінності лігандів до АПФ2. Створено нові обчислювальні робочі процеси, які можуть бути використані для аналізу інших цинк-залежних ферментів. Отримано хімічні зонди з підтвердженою біологічною активністю та структурною новизною, три з яких подано на реєстрацію в Chemical Probe Portal.
Практичне значення одержаних результатів визначається створенням та оптимізацією хімічних сполук, які можуть бути застосовані як високоякісні молекулярні зонди для фундаментальних досліджень ролі АПФ2 у фізіології та патології, зокрема та його роль в розповсюдженні та наслідках COVID-19. Розроблені підходи дозволяють проводити скринінг і оптимізацію лігандів для широкого спектра біологічних мішеней. Запропоновані методики можуть бути інтегровані в існуючі платформи комп’ютерного дизайну ліків, забезпечуючи швидкий перехід від первинного відбору до вдосконалення хітів та синтезу активних речовин у масштабах, придатних для біологічного тестування. Результати цієї роботи створюють основу для подальших розробок у сфері таргетної терапії та вивчення сигнальних шляхів, пов’язаних з АПФ2, що визначається можливістю створення нових інструментальних сполук — молекулярних зондів для фундаментального вивчення АПФ2. Запропоновані підходи можна застосовувати для дослідження інших біологічних мішеней і впровадження у сучасні платформи віртуального скринінгу та подальшої оптимізації активних сполук.