Пономаренко, Станіслав ІгоровичСтаніслав ІгоровичПономаренкоПрилуцький, Юрій Іванович2025-10-212025-10-212025-07-16Пономаренко С. І. Цитотоксичність доксорубіцину та цисплатину у складі рН- і термо-чутливих розгалужених полімерів : дис. … доктора філософії : 091 Біологія. Київ, 2025. 100 с.УДК 576.36/.385:615.3/.9.014:620.3https://ir.library.knu.ua/handle/15071834/8264Пономаренко С.І. ЦИТОТОКСИЧНІСТЬ ДОКСОРУБІЦИНУ ТА ЦИСПЛАТИНУ У СКЛАДІ рН- І ТЕРМО-ЧУТЛИВИХ РОЗГАЛУЖЕНИХ ПОЛІМЕРІВ. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 «Біологія» (09 – «Біологія») – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Міністерство освіти і науки України, – Київ, 2025. Вперше створено нові водорозчинні протипухлинні препарати на основі рН- і термо-чутливих розгалужених полімерів, D-g-PAAan і D(D6 або D70)-g-PNIPAM, відповідно, які містять молекули Dox та Cis, що підтверджено даними інфрачервоної спектроскопії і динамічного розсіювання світла. За використання МТТ-тесту та аналізу живі/мертві клітини не виявлено токсичної дії водорозчинних частинок полімерів D-g-PAAan і D-g-PNIPAM на нормальні (HEK293 та HEL299) та пухлинні клітини (MC3T3, A549, HeLa, LLC і LLC/DoxR) у досліджуваних концентраціях, що свідчить про перспективність їх використання як безпечної наноплатформи для доставки протипухлинних ліків. За використання поєднаних методів високоефективної рідинної хроматографії та мас-спектрометрії показано, що полімерна матриця D-g-PAAan, яка містила Dox або Cis, вивільняла хіміопрепарат у відповідь на зниження pH середовища до 5,0 (модель пухлинного сайту), що вказує на можливість його цільової доставки, викликаної зміною pH. За використання конфокальної мікроскопії продемонстровано поглинання частинок D-g-PAAan+Dox та D-g-PNIPAM+Dox пухлинними клітинами MC3T3 та HeLa. Виявлено концентраційно- та часо-залежне посилення токсичних ефектів цитостатиків Dox або Cis у складі полімерів D-g-PAAan і D-g-PNIPAM у досліджуваних системах in vitro. Так, частинки D-g-PAAan значно підвищували токсичний потенціал хіміопрепаратів Dox та Cis у їх складі щодо клітин карциноми легень людини та миші (A549 та LLC), але не щодо нормальних клітин легень людини (HEL299). Навантажені хіміопрепаратом (Dox або Cis) частинки D-g-PAAan сприяли подальшому окисному стресу та індукції апоптозу у клітинах LLC шляхом підвищення внутрішньоклітинного продукування АФК та активності каспази 3/7. Виявлені селективні цитотоксичні ефекти протипухлинних препаратів Dox і Cis за їх інкапсуляції у полімерну матрицю D-g-PAAаn свідчать про диференціацію взаємодії між новоствореними комплексами та пухлинними і нормальними клітинами, відповідно, що підтверджує перспективність їх використання у протипухлинній терапії. Посилення внутрішньоклітинного накопичення Dox при транспортуванні у складі полімеру D-g-PAAan та модулюючий ефект цитотоксичності хіміотерапевтичних препаратів Dox і Cis у складі полімеру D-g-PAAаn, підтверджені на 3D сфероїдній моделі клітин LLC, свідчать про перспективність застосування водорозчинних частинок полімеру D-g-PAAаn для цільової доставки хіміопрепаратів у системи in vivo. Цитотоксична дія Dox і Cis у складі комплексів полімерів D(D6 або D70)-g-PNIPAM є значно ефективнішою, ніж їхня токсична дія окремо щодо чутливих і резистентних до Dox клітин лінії LLC, про що свідчило підвищення внутрішньоклітинного рівня АФК, зниження вмісту АТФ та посилення активності каспази 3/7 порівняно з окремою дією цих цитостатиків за еквівалентної концентрації. Встановлено, що токсичність Cis у комплексах D(D6 або D70)-g-PNIPAM щодо клітин LLC підвищується за низьких концентрацій хіміопрепарату. Крім того, чутливість клітин LLC/DoxR до дії досліджуваних комплексів полімерів D(D6 або D70)-g-PNIPAM з хіміопрепаратами була вищою порівняно з чутливими клітинами LLC, що свідчить про посилення цитотоксичних ефектів хіміопрепаратів полімерами та модифікацію процесів стійкості у клітин до цитостатиків. Токсична дія поглинених клітинами HeLa частинок D70-g-PNIPAM+Dox значно зростала зі збільшенням концентрації Dox. Оскільки водорозчинний полімер D70-g-PNIPAM сильно чутливий до температури середовища, можна припустити, що потрапляючи у патологічні ділянки з підвищеною температурою (~37 °C), частинки D70-g-PNIPAM зазнаватимуть конформаційної перебудови і, таким чином, вивільнятимуть ліки локально. Відтак, включення Dox до структури D70-g-PNIPAM дозволяє не лише оптимізувати його фармакокінетику, але й підвищити діючу концентрацію препарату. Таким чином, одержані вперше результати свідчать про те, що запропонована стратегія інкапсуляції протипухлинних препаратів у полімерні матриці D-g-PAAаn і D-g-PNIPAM дозволяє не лише реалізувати відповідне рН- і термо-таргетне вивільнення хіміопрепаратів, але й посилити їх токсичну дію на пухлинні клітини.Ponomarenko S.I. CYTOTOXICITY OF DOXORUBICIN AND CISPLATIN IN COMPOSITION OF pH- AND THERMO-SENSITIVE BRANCHED POLYMERS. - Qualification scientific work on the rights of the manuscript. Dissertation for the degree of Doctor of Philosophy in the specialty 091 "Biology" (09 – "Biology") - Taras Shevchenko National University of Kyiv, Ministry of Education and Science of Ukraine - Kyiv, 2025. New water-soluble anticancer drugs based on pH- and thermo-sensitive branched polymers, D-g-PAAan and D(D6 or D70)-g-PNIPAM, respectively, containing Dox and Cis molecules, were created for the first time, which was confirmed by infrared spectroscopy and dynamic light scattering data. Using the MTT test and live/dead cell analysis, no toxic effect of water-soluble particles of D-g-PAAan and D-g-PNIPAM polymers on normal (HEK293 and HEL299) and tumor cells (MC3T3, A549, HeLa, LLC and LLC/DoxR) was detected in the studied concentrations, which indicates the prospect of their use as a safe nanoplatform for the delivery of anticancer drugs. Using the combined methods of high-performance liquid chromatography and mass spectrometry, it was shown that the D-g-PAAan polymer matrix, which contained Dox or Cis, released the chemopreparation in response to a decrease in the pH of the medium to 5.0 (tumor site model), indicating the possibility of its targeting of delivery caused by a change in pH. Using confocal microscopy, the uptake of D-g-PAAan+Dox and D-g-PNIPAM+Dox particles by MC3T3 аnd HeLa tumor cells was demonstrated. A concentration- and time-dependent enhancement of the toxic effects of the Dox or Cis cytostatics in the composition of D-g-PAAan and D-g-PNIPAM polymers was revealed in the studied in vitro systems. So, the D-g-PAAan particles significantly increased the toxic potential of Dox and Cis chemopreparations in their composition against human and mouse lung carcinoma cells (A549 and LLC), but not against normal human lung cells (HEL299). Chemodrug (Dox or Cis)-loaded D-g-PAAan particles promoted subsequent oxidative stress and apoptosis induction in LLC cells by increasing intracellular ROS production and caspase 3/7 activation. The revealed selective cytotoxic effects of the Dox and Cis antitumor drugs after their encapsulation in the D-g-PAAаn polymer matrix testify to the differentiation of the interaction between the newly formed complexes and tumor and normal cells, respectively, which confirms the perspective of their use in antitumor therapy. The enhancement of intracellular accumulation of Dox during transport in the composition of the D-g-PAAan polymer and the modulatory effect of the cytotoxicity of Dox and Cis chemotherapy drugs in the composition of the D-g-PAAan polymer, confirmed on a 3D spheroid model of LLC cells, testify to the promising application of water-soluble particles of the D-g-PAAan polymer for the targeted delivery of chemotherapy drugs in the in vivo system. The cytotoxic action of Dox and Cis in the composition of D(D6 or D70)-g-PNIPAM polymer complexes is significantly more effective than their toxic action alone against the Dox-sensitive and resistant LLC cells, which was evidenced by an increase in the intracellular level of ROS, a decrease in the content of ATP and activation of caspase 3/7 compared to by the separate action of these cytostatics at an equivalent concentration. It was established that the toxicity of Cis in the D(D6 or D70)-g-PNIPAM complexes against LLC cells increases at low concentrations of the chemotherapy drug. In addition, the sensitivity of LLC/DoxR cells to the action of the studied D(D6 or D70)-g-PNIPAM polymer complexes with chemopreparations was higher compared to sensitive LLC cells, which indicates an enhancement of the cytotoxic effects of chemopreparations by polymers and a modification of the processes of cell resistance to cytostatics. The toxic effect of D70-g-PNIPAM+Dox particles absorbed by HeLa cells increased significantly with increasing Dox concentration. Since the water-soluble D70-g-PNIPAM polymer is highly sensitive to the temperature of the environment, it can be assumed that when entering the pathological areas with elevated temperature (~37 °C), the D70-g-PNIPAM particles will undergo conformational rearrangement and thus release drugs locally. Therefore, the inclusion of Dox in the structure of D70-g-PNIPAM allows not only to optimize its pharmacokinetics, but also to increase the effective concentration of the drug. Thus, the results obtained for the first time indicate that the proposed strategy of encapsulation of anticancer drugs in the D-g-PAAаn and D-g-PNIPAM polymer matrices allows not only to realize the appropriate pH- and thermo-targeted release of chemopreparations, but also to enhance their toxic effect on tumor cells.ukрозгалужені полімери/кополімериполімер наноносійдоксорубіцинцисплатинкомплекси/нанокомплексІЧ поглинаннязв'язок структура-активністьпротиракова активністьцитотоксичністьбіохімічне характеризування/біохімічні показникиплазматична мембранадоставка ліківактивні форми киснюокисний стресокисний метаболізмbranched polymers/copolymerspolymer nanocarrierdoxorubicincisplatinсomplexes/nanocomplexstructure-activity relationshipIR absorptionanticancer activitycytotoxicitybiochemical characterization/biochemical indicatorsplasma membranedrug deliveryreactive oxygen speciesoxidative stressoxidative metabolismДисертація