Киричок Олександр ОлександровичМихайлюк Павло Костянтинович2024-06-132024-06-132024Киричок О. О. Синтез нових поліфункціональних спіроциклічних азетидинів методом [2+2] циклоприєднання та їх застосування в медичній хімії : дис. … д-ра філософії : 102 Хімія / Киричок Олександр Олександрович. – Київ, 2024. – 186 с.УДК 547.7;577.1https://ir.library.knu.ua/handle/15071834/1964Дисертація присвячена розробці препаративних методів cинтезу нових мультифункціональних спіроциклічних азетидинів шляхом [2+2] циклопри-єднання та їх застосуванню у розробці фармакологічних препаратів. Перший розділ дослідження описує синтез 2-заміщених азаспіро[3.3]гептанів як спіроциклічних аналогів 2-заміщених піперидинів та їх валідацію у відкритті ліків. Для синтезу цільової спіроциклічної сполуки було використано модифікацію реакції Штаудінгера між кетенами та N-TMS-імінами для NH-азетидинонів. Комерційно доступна циклобутанкарбонова кислота була легко перетворена на відповідний хлорангидрид і далі на кетен шляхом обробки DIPEA. У свою чергу бензальдегід був перетворений in situ на TMS-імін дією LiN(TMS)2. Наступна термічна реакція Штаудінгера між кетеном і TMS-іміном дала бажаний спіроциклічний азетидинон (3-феніл-2-азаспіро[3.3]гептан-1-он) з виходом 81%. Подальше відновлення амідної групи дало цільовий амін (1-феніл-2-азаспіро[3.3]гептан) з виходом 76%. Обидві вихідні речовини (циклобутанкарбонова кислота і бензальдегід) – є досить недорогими і доступними реагентами, що дозволило здійснити масштабування реакції і отримати 50 г ключового аміну за один синтетичний підхід. Далі було досліджено межі застосування реакції, а саме проведено варіювання альдегідної складової перетворення: ряд як ароматичних (у тому числі гетероароматичних), так і аліфатичних альдегідів був успішно перетворений на відповідні спіроциклічні похідні. Структуру однієї з одержаних спіроциклічних похідних, а саме 1-(піридин-3-іл)-2-азаспіро[3.3]гептану було підтверджено за допомогою рентгеноструктурного дослідження. Далі було вивчено фізико-хімічні характеристики синтезованих спіроциклічних будівельних блоків і порівняно одержані дані з даними для відповідних похідних піперидинів. Усі синтезовані спіроциклічні похідні мали належні фізико-хімічні властивості для використання у розробці ліків: вони були хімічно та метаболічно стабільними in vitro, мали належну ліпофільність і хорошу розчинність у воді. Для демонстрації потенціалу синтезованих спіроциклічних аналогів 2-заміщених піперидинів для розробки ліків було синтезовано спіроциклічний аналог бупівакаїну (місцевого анестетика, схваленого FDA) з залишком 2-азаспіро[3.3]гептану замість піперидину. Спіроциклічна похідна продемонструвала аналогічну тривалість, але водночас швидший початок дії in vivo порівняно з бупівакаїном. Крім того, спіроциклічна сполука показала дещо нижчий рівень системної токсичності у мишей in vivo. Наступні дослідження присвячені розширенню раніше розробленої методології на поліфункціональні аналоги 2-заміщених піперидинів. Як ключову комерційно доступну модельну сполуку було обрано N-Bz-захищену піперидин-4-карбонову кислоту. Для синтезу NH-азетидинонів було знову використано модифікацію реакції Штаудінгера між кетенами та N-TMS імінами. Спочатку кислота була легко перетворена на відповідний хлорангидрид і далі на кетен. Водночас відповідний альдегід (ізобутиральдегід) був перетворений на TMS-імін in situ шляхом обробки LiN(TMS)2. Наступна термічна реакція Штаудінгера між кетеном і TMS-іміном дала бажаний спіроциклічний азетидинон з виходом 64%. Відновлення обох амідних груп дією AlH3 завершило синтез захищеного N-Bn-1-ізопропіл-2,7-діазаспіро[3.5]нонану з виходом 92%. Пізніше всі ці перетворення були успішно масштабовані, що дозволило отримати 20 г цільового спіроциклічного продукту за один синтетичний підхід. Логічним продовженням досліджень було вивчення меж розробленої процедури. Було проведено варіювання розміру циклів (5-, 6-, 7-членний), а також гетероатомів у циклі (O, N, S). Як партнери в реакції Штаудінгера були використані ароматичні, гетероароматичні та аліфатичні альдегіди. Усі спіроциклічні продукти були отримані з виходами від помірних до високих (36-94%). Варто зауважити, що розроблена методологія добре спрацювала для циклічних кислот з гетероатомом у α- та γ-положенні, проте кислоти з гетероатомами в β-положенні давали лише складні суміші. Структура деяких спіроциклічних продуктів була підтверджена за допомогою рентгеноструктурного дослідження. Наступним етапом стала модифікація деяких з одержаних спіроциклів. Зокрема було проведено окиснення атома сульфуру похідної 1-ізопропіл-7-тіа-2-азаспіро[3.5]нонану з одержанням відповідного 7,7-діоксиду. N-Boc-захист 5-бензил-1-ізопропіл-2,5-діазаспіро[3.4]октану і подальше розщеплення N-Bn гідруванням дали N-Boc-1-ізопропіл-2,5-діазаспіро[3.4]октан-2-карбоксилат. Також 1-ізопропіл-2-азаспіро[3.4]окт-6-ен був у декілька стадій перетворений на аміноспирт – 7-аміно-2-етил-1-ізопропіл-2-азаспіро[3.4]октан-6-ол. Нарешті, захист N-Boc і наступне окиснення фуранового кільця дією NaIO4/RuCl3 на сполуки 1-(фуран-2-іл)-2-азаспіро[3.4]октан та 1-(фуран-2-іл)-7-окса-2-азаспіро[3.5]нонан з подальшим кислотним розщепленням групи N-Boc дали відповідні спіроциклічні амінокислоти. Для одержаних амінокислот далі були вивченні властивостей їхніх N-амідних зв’язків, які є важливими характеристиками для пептидоміметиків. Експериментально було встановлено, що співвідношення транс-/цис- конформерів і відповідні швидкості взаємоперетворення є близькими для модельних похідних азетидину і піперидину. Для підтвердження цінності синтезованих будівельних блоків у розробці ліків були синтезовані спіроциклічні аналоги бупівакаїну на основі 2-азаспіро[3.4]октан-1-карбонової кислоти та 7-окса-2-азаспіро[3.5]нонан-1-карбонової кислоти. Експериментальні ADME-параметри – ліпофільність (logD), розчинність у воді та метаболічна стабільність у печінці (CLint) виявились дуже близькими до бупівакаїну. Водночас спіроциклічні аналоги продемонстрували значно меншу токсичність, ніж бупівакаїн. Одержані результати демонструють високу ефективність ізостеричних замін у дизайні препарату. Наступний розділ дослідження присвячений розробці модульного підходу до синтезу похідних 1-азаспіро[3.3]гептанів, який би дозволяв одержання сполук лише з одним замісником (одним вихідним вектором) в ядрі без додаткового (полі)заміщення. Синтез 1-азаспіро[3.3]гептану починали з комерційно доступного циклобутанону. Реакція Віттіга дала відповідний алкен, який після додавання ізоціанату Графа (ClO2S–NCO) утворив спіроциклічний лактам. Далі було здійснено пошук найкраших умов відновлення лактаму з метою мінімізації побічного процесу розкриття циклу з утворенням відповідного аміноспирту. Було знайдено, що використання алану AlH3 дозволило отримати бажаний амін 1-азаспіро[3.3]гептан із чудовим виходом 89%. Далі ключова стадія відновлення була відтворена у мультиграмовому масштабі, неочищений продукт був перетворений на відповідний гідрохлорид і виділений у вигляді білої твердої речовини з виходом 66%. Структура 1-азаспіро[3.3]гептану була підтверджена за допомогою рентгеноструктурного дослідження. Таким чином, оптимізована методика дозволила синтезувати 54 г ключової сполуки за один синтетичний підхід. Далі було досліджено межі застосування розробленого підходу. Були випробувані різні заміщені алкени, більшість з яких були отримані за реакцією Віттіга з відповідних циклобутанонів. Було знайдено, що алкіл-, арил-, діалкіл- і бензилоксизаміщені алкени добре сумісні зі стадією циклоприєднання, що дозволило легко отримати відповідні β-лактами. Подальше відновлення давало різноманітні заміщені 1-азаспіро[3.3]гептани. При цьому лактами, що містили карбоксиметильну (-CO2Me) групу були відновлені до водорозчинних аміноспиртів, які були далі N-захищені з утворенням N-Boc-аміноспиртів для полегшення виділення продуктів реакції. Подібним чином лактами, що містили нітрильну (-CN) групу утворювали діаміни, які далі також були перетворені на N-захищені ди-Boc-похідні. Слід зазначити, що всі вищезгадані продукти були отримані у грамових кількостях. У більшості випадків β-лактами утворювалися з чистотою більше 90% після стандартної обробки реакційної суміші. У міліграмовому масштабі продукти були очищені для одержання аналітичних зразків. Однак у грамових масштабах лактами були використані безпосередньо у наступній стадії відновлення, що таким чином забезпечило вищий загальний вихід цільових 1-азаспіро[3.3]гептанів. Будову ряду похідних було підтверджено за допомогою рентгеноструктурного дослідження. Використання заміщених алкенів дозволило урізноманітнити циклобутанове кільце 1-азаспіро[3.3]гептанів. Для функціоналізації азетидинового кільця було проведено захист 1-азаспіро[3.3]гептан-2-ону -SiMe2t-Bu групою. Наступна обробка захищеного лактаму LDA генерувала карбаніон, який далі реагував з різними електрофілами – алкілйодидами, алкілбромідами, кетонами, Me2S2 – з утворенням (після зняття N-захисної групи) відповідних різноманітно заміщених β-лактамів. Далі були виконані модифікації ядра 1-азаспіро[3.3]гептану для отримання будівельних блоків для потреб медичної хімії. Так, окиснення за Сверном спіроцикліного аміноспирту дало N-Boc-аміноальдегід, який далі реагував з гліоксалем/(NH4)2CO3 з утворенням 6-(1H-імідазол-2-іл)-1-азаспіро[3.3]гептану, а також з гідроксил-аміном з подальшим відновленням проміжного оксиму з утворенням похідної 6-(амінометил)-1-азаспіро[3.3]гептану. Окиснення спиртової групи спіроцик-лічного аміноспирту дією NaIO4/RuCl3 дало N-Boc-1-азаспіро[3.3]гептан-6-карбонову кислоту з виходом 76%. Захист 1-азаспіро[3.3]гептану дією Boc2О з подальшою обробкою втор-BuLi/TMEDA та додаванням сухого льоду дали унікальну амінокислоту 1-азаспіро[3.3]гептан-2-карбонову кислоту – аналог α-піпеколінової кислоти. Далі було досліджено експериментальні фізико-хімічних властивості ряду одержаних заміщених 1-азаспіро[3.3]гептанів. Було знайдено, що у досліджу-ваних субстратах основність атома нітрогену була майже ідентичною з основністю піперидину, підкреслюючи таким чином потенціал 1-азаспіро-[3.3]гептану для заміни піперидину в біохімічному контексті. Для вивчення впливу заміни піперидинового кільця на 1-азаспіро-[3.3]гептановий скелет було одержано модельний амід [1,1'-біфеніл]-4-іл(1-азаспіро[3.3]гептан-1-іл)метанон і порівняно його з аналогами на основі піперидину та ізомерного 2-азаспіро[3.3]гептану. Було показано, що заміна піперидинового кільця на його біциклічні аналоги призводить до зменшення розчинності у воді. Під час оцінки впливу заміни піперидинового кільця біциклічними аналогами на ліпофільність молекул спостерігали невелике збільшення (на 0,3 одиниці) в експериментальних значеннях logD7.4 для спіроциклів порівняно з піперидином. Також було показано, що включення обох азаспіро[3.3]гептанів знижує метаболічну стабільність у мікросомах печінки людини порівняно з похідною піперидину. Для підтвердження перспектив заміни піперидинового кільця на залишок 1-азаспіро[3.3]гептанового каркасу у медичних проектах, було введено цей скелет у структуру бупівакаїну. Було проведено експериментальне визначення анестезуючої активності бупівакаїну та його спіроциклічного аналога in vivo. Було досліджено антиноцицептивний ефект бупівакаїну та спіроциклічного аналога за допомогою тесту на рух хвостом у мишей Balb/cAnN. Спіроциклічний аналог бупівакаїну показав значну анестетичну активність in vivo, що створює перспективи застосування подібної ізостерної заміни у проектах з розробки лікарських препаратів.The dissertation is devoted to the development of preparative methods for the synthesis of new multifunctional spirocyclic azetidines by [2+2]cycloaddition and their application in drug discovery. The first chapter of the study describes the synthesis of 2-substituted azaspiro[3.3]heptanes as spirocyclic analogs of 2-substituted piperidines and their validation in drug discovery. A modification of the Staudinger reaction between ketenes and N-TMS-imines for NH-azetidinones was used for the synthesis of the target spirocycle. Commercially available cyclobutane carboxylic acid was readily converted to the corresponding chloro anhydride and then to the ketene by treatment with DIPEA. In turn, benzaldehyde was converted in situ to TMS-imine by LiN(TMS)2. A subsequent thermal Staudinger reaction between ketene and TMS-imine afforded the desired spirocyclic azetidinone (3-phenyl-2-azaspiro[3.3]heptan-1-one) in 81% yield. Further reduction of the amide group gave the desired amine (1-phenyl-2-azaspiro[3.3]heptane) in 76% yield. Both starting substances (cyclobutane carboxylic acid and benzaldehyde) are quite inexpensive and available reagents, which made it possible to scale up the reaction and obtain 50 g of the key amine in one synthetic run. Next, the scopes and limitations of the reaction were investigated, namely, the variation of the aldehyde component of the transformation was carried out: a number of aromatic, heteroatomic, and aliphatic aldehydes were successfully transformed into the corresponding spirocyclic derivatives. The structure of one of the obtained spirocyclic derivatives, 1-(pyridin-3-yl)-2-azaspiro[3.3]heptane, was confirmed by X-ray diffraction. Further, the physicochemical characteristics of the synthesized spirocyclic building blocks were investigated and the data obtained were compared with the data of the corresponding piperidine derivatives. All synthesized spirocyclic derivatives had appropriate physicochemical properties for use in drug discovery: they were chemically and metabolically stable in vitro, had appropriate lipophilicity and good solubility in water. To demonstrate the drug discovery potential of the synthesized spirocyclic analogs of 2-substituted piperidines, a spirocyclic analog of bupivacaine (an FDA-approved local anesthetic) with a 2-azaspiro[3.3]heptane residue instead of piperidine was synthesized. The spirocyclic derivative showed a similar duration, but at the same time a faster onset of action in vivo compared to bupivacaine. In addition, the spirocyclic compound showed a slightly lower level of toxicity in mice in vivo. The following studies are devoted to the extension of the previously developed methodology to polyfunctional analogues of 2-substituted piperidines. N-Bz-protected piperidine-4-carboxylic acid was chosen as a key commercially available model compound. A modification of the Staudinger reaction between ketenes and N-TMS imines was used for the synthesis of NH-azetidinones. First, the acid was easily converted to the corresponding chloride and then to ketene. At the same time, the corresponding aldehyde (isobutyraldehyde) was converted to TMS-imine in situ by treatment with LiN(TMS)2. A subsequent thermal Staudinger reaction between ketene and TMS-imine gave the desired spirocyclic azetidinone in 64% yield. Reduction of both amide groups of the compound by the action of AlH3 completed the synthesis of protected N-Bn-1-isopropyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane with a yield of 92%. Later, all these transformations were successfully scaled up, allowing to obtain 20 g of the target spirocyclic product in one synthetic run. The continuation of the research was the study of the limits of the developed procedure. The size of the rings (5-, 6-, 7-membered) and heteroatoms in the ring (O, N, S) were varied. Aromatic, heteroaromatic and aliphatic aldehydes were used as partners in the Staudinger reaction. All spirocyclic products were obtained in moderate to high yields (36-94%). It is worth noting that the developed methodology worked well for cyclic acids with a heteroatom in the α- and γ-position, but acids with heteroatoms in the β-position gave only complex mixtures. The structure of some spirocyclic products was confirmed by X-ray diffraction. The next stage was the modification of some of the obtained spirocycles. In particular, the sulfur atom of the 1-isopropyl-7-thia-2-azaspiro[3.5]nonane derivative was oxidized to obtain the corresponding 7,7-dioxide. N-Boc protection of 5-benzyl-1-isopropyl-2,5-diazaspiro[3.4]octane and subsequent cleavage of N-Bn by hydrogenation gave N-Boc 1-isopropyl-2,5-diazaspiro[3.4]octane. 1-Isopropyl-2-azaspiro[3.4]oct-6-ene was transformed in several stages into amino alcohol – 7-amino-2-ethyl-1-isopropyl-2-azaspiro[3.4]octane-6-ol. Finally, protection of N-Boc and subsequent oxidation of the furan ring by the action of NaIO4/RuCl3 on compounds 1-(furan-2-yl)-2-azaspiro[3.4]octane and 1-(furan-2-yl)-7-oxa-2-azaspiro-[3.5]nonane and subsequent acid cleavage of the N-Boc group gave the corresponding spirocyclic amino acids. For the obtained amino acids, the properties of their N-amide bonds, which are important characteristics for peptidomimetics, were further studied. It was experimentally established that the ratio of trans-/cis-conformers and the corresponding rates of interconversion are similar for reference derivatives of azetidine and piperidine. To confirm the value of synthesized building blocks in drug discovery, spirocyclic analogues of bupivacaine based on 2-azaspiro[3.4]octane-1-carboxylic acid and 7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonane-1-carboxylic acid were synthesized. Experimental ADME parameters - lipophilicity (logD), water solubility and metabolic stability in the liver (CLint) were found to be very close to bupivacaine. At the same time, spirocyclic analogues of bupivacaine showed much lower toxicity than bupivacaine. The obtained results demonstrate the high efficiency of isosteric substitutions in drug design. The next section of the study is devoted to the development of a modular approach to the synthesis of 1-azaspiro[3.3]heptane derivatives, which would allow the preparation of compounds with only one substituent (one exit vector) in the core without additional (poly)substitution. The synthesis of 1-azaspiro[3.3]heptane was started from commercially available cyclobutanone. The Wittig reaction gave the corresponding alkene, which after addition of Graf isocyanate (ClO2S–NCO) formed a spirocyclic lactam. Next, the search for the best conditions for the reduction of the lactam was carried out in order to minimize the side process of ring opening with the formation of the corresponding amino alcohol. It was found that the use of the alane AlH3 afforded the desired amine 1-azaspiro[3.3]heptane in an excellent yield of 89%. Next, the key reduction step was repeated on a multigram scale, the crude product was converted to the corresponding hydrochloride and isolated as a white solid in 66% yield. The structure of 1-azaspiro[3.3]heptane was confirmed by X-ray structural analysis. Thus, the optimized technique made it possible to synthesize 54 g of the key compound in one synthetic run. Next, the limits of application of the developed approach were investigated. Various substituted alkenes were tested, most of which were prepared by the Wittig reaction from the corresponding cyclobutanones. Alkyl, aryl, dialkyl, and benzyloxy-substituted alkenes were found to be well compatible with the cycloaddition step, allowing easy preparation of the corresponding β-lactams. Further reduction afforded a variety of substituted 1-azaspiro[3.3]heptanes. At the same time, lactams containing a carboxymethyl (-CO2Me) group were reduced to water-soluble amino alcohols, which were further N-protected to form N-Boc-amino alcohols to facilitate the isolation of reaction products. Similarly, lactams containing a nitrile (-CN) group formed diamines, which were also further converted to N-protected di-Boc derivatives. It should be noted that all the above-mentioned products were obtained in gram quantities. In most cases, β-lactams were formed with a purity of more than 90% after standard work-up of the reaction mixture. On a milligram scale, the products were purified to obtain analytical samples. However, on a gram scale, the lactams were used directly in the next reduction step and thus provided a higher overall yield of the target 1-azaspiro[3.3]heptanes. The structure of a series of derivatives was confirmed by X-ray diffraction. The use of substituted alkenes made it possible to diversify the cyclobutane ring of the 1-azaspiro[3.3]heptanes. To diversify the azetidine ring, 1-azaspiro[3.3]heptan-2-one was protected with a -SiMe2tBu group. Subsequent LDA treatment of the protected lactam generated a carbanion, which then reacted with various electrophiles – alkyl iodides, alkyl bromides, ketones, Me2S2 – with the formation (after removal of the N-protecting group) of the corresponding variously substituted β-lactams. Further, modifications of the 1-azaspiro[3.3]heptane core were performed to obtain building blocks for medicinal chemistry needs. Thus, Swern oxidation of spirocyclic aminoalcohol gave N-Boc aminoaldehyde, which further reacted with glyoxal/(NH4)2CO3 to form 6-(1H-imidazol-2-yl)-1-azaspiro[3.3]-heptane, as well as with hydroxylamine followed by reduction of the intermediate oxime with the formation of the 6-(aminomethyl)-1-azaspiro[3.3]heptane derivative. Oxidation of the alcohol group of spirocyclic aminoalcohol under the action of NaIO4/RuCl3 gave N-Boc 1-azaspiro[3.3]heptane-6-carboxylic acid with a yield of 76%. Protection of 1-azaspiro[3.3]heptane by Boc2O followed by treatment of sec-BuLi/TMEDA and the addition of dry ice yielded a unique amino acid 1-azaspiro[3.3]heptane-2-carboxylic acid – an analogue of α-pipecolic acid. Further, the experimental physicochemical properties of a number of substituted 1-azaspiro[3.3]heptanes obtained were investigated. It was found that in the studied compounds, the basicity of the nitrogen atom was almost identical to that of piperidine, thus emphasizing the potential of 1-azaspiro[3.3]heptane to replace piperidine in a biochemical context. To study the influence of piperidine ring substitution on the 1-azaspiro-[3.3]heptane skeleton, a model amide [1,1'-biphenyl]-4-yl(1-azaspiro[3.3]heptan-1-yl)methanone was used and compared with its analogues based on piperidine and isomeric 2-azaspiro[3.3]heptane. It was shown that the replacement of the piperidine ring with its bicyclic analogues leads to a decrease in solubility in water. When evaluating the effect of replacing the piperidine ring with bicyclic analogues on the lipophilicity of molecules, a small increase (by 0.3 units) was observed in the experimental values of logD7.4 for spirocycles compared to piperidine. Incorporation of both azaspiro[3.3]heptanes was also shown to decrease metabolic stability in human liver microsomes compared to the piperidine derivative. To confirm the prospects of replacing the piperidine ring with the remainder of the 1-azaspiro[3.3]heptane skeleton in medical projects, this skeleton was introduced into the structure of bupivacaine. An experimental determination of the anesthetic activity of bupivacaine and its spirocyclic analogue in vivo was carried out. The antinociceptive effect of bupivacaine and a spirocyclic analogue was investigated using the tail-flick test in mice Balb/cAnN. The spirocyclic analogue of bupivacaine has shown significant anesthetic activity in vivo, which creates prospects for the use of such isosteric substitution in drug discovery projects.ua2-азаспіро[3.3]гептан1-азаспіро[3.3]гептаназетидинпіперидинспіроциклічні будівельні блокибіоізостерициклоприєднаннягетероцикли2-azaspiro[3.3]heptane1-azaspiro[3.3]heptaneazetidinepiperidinespirocyclic building blocksbioisosterescycloadditionheterocyclesДисертація