Кравець, Ірина ОлександрівнаІрина ОлександрівнаКравецьРябухін, Сергій Вікторович2025-09-172025-09-172025-07-16Кравець І. О. Дизайн та пошук потенційних інгібіторів ангіотензин перетворювального ферменту2 (АПФ2 - англ. ACE2) : дис. ... доктора філософії : 102 Хімія. Київ, 2025. 192 с.УДК [54.057+519.688]:612.146:577.15https://ir.library.knu.ua/handle/15071834/7740Кравець І.О. Дизайн та пошук потенційних інгібіторів ангіотензин перетворювального ферменту2 (АПФ2 - англ. ACE2). - Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 102 Хімія (10 – Природничі науки). - Інститут високих технологій Київського національного університету ім.Т.Шевченко, Київ, 2025. Дисертаційна робота присвячена дизайну та пошуку потенційних інгібіторів ангіотензин-перетворювального ферменту2 (АПФ2). У рамках роботи виконано такі завдання: Ідентифіковано нові хемотипи серед структурно подібних аналогів відомих інгібіторів, що демонструють підтверджену селективну активність щодо АПФ2. Синтезовано та охарактеризовано молекули, з метою подальшої біологічної оцінки. Оптимізовано низку відомих синтетичних шляхів та розроблено нові ефективні підходи до синтезу ключових сполук-зондів. Удосконалення процесів дозволило значно збільшити вихід цільових речовин (до десятків грамів), знизити витрати на реагенти та спростити апаратну реалізацію реакцій. Це стало можливим завдяки відмові від дорогих реагентів, впровадженню більш доступного лабораторного обладнання та загальній оптимізації умов синтезу. Із літературно описаних інгібіторів АПФ2 два були синтезовані в необхідних кількостях за валідованими процедурами. Три сполуки подано для реєстрації на міжнародному порталі Chemical Probe Portal (https://www.chemicalprobes.org/) в якості хімічних зондів — авторитетному ресурсі для верифікації молекулярних інструментів у біомедичних дослідженнях. Адаптований біохімічний методу для скринінгу інгібіторів АПФ2, а саме наявний комерційний набір Abcam (ab273373), оптимізувавши об’єми реакційної суміші та концентрації ключових компонентів (ферменту, субстрату, інгібітора), що дозволило досягти надійного аналітичного сигналу навіть при зменшеному загальному об’ємі реакції (до 25 мкл). Метод було валідувано шляхом визначення IC₅₀ для референтних інгібіторів (MLN-4760 та DX600) в нових умовах. Це забезпечило можливість проведення високопродуктивного скринінгу (HTS) для 577 відібраних in silico сполук з подальшою побудовою дозозалежних кривих для підтверджених активних хітів. Розроблено і валідовано нові моделі докінгу для мішеней АПФ2 та АПФ. Отримані in silico моделі продемонстрували високу точність при прогнозуванні активності відомих лігандів, що дало змогу оцінити селективність взаємодії з ферментами АПФ2/АПФ (англ. ACE) для створення набору низькомолекулярних хімічних зондів для специфічного інгібування АПФ2. Реалізовано високопродуктивний підхід до віртуального скринінгу з фокусом на хемотипове різноманіття. Завдяки цьому підходу було опрацьовано бібліотеки молекул обсягом до 1,4 млрд. сполук із високою ефективністю щодо часу обчислень і ресурсів. Запропоновано оптимізовані протоколи, що забезпечують до десятикратного зменшення обчислювальних витрат за рахунок раціонального комбінування швидких попередніх фільтрів і більш точних розрахунків. Проведено віртуальний скринінг Enamine In-Stock колекції із використанням трьох незалежно валідованих робочих процесів. Вибрані комплекси були додатково проаналізовані методами молекулярної динаміки для верифікації стабільності зв’язування. На основі результатів комп’ютерного скринінгу було відібрано та протестовано 577 сполук із Enamine In-Stock колекції в експериментальному ферментативному аналізі з використанням флуоресцентного методу (HTS-формат). Для двох еталонних сполук ("Abcam" та EN300-22203532) визначено IC50 значення — 185 нМ і 0,9 нМ відповідно. Виявлено 7 нових хітів, які продемонстрували рівень інгібування >30%. Для цих семи активних сполук побудовані криві залежності доза-відповідь (DRC), що підтвердило їхню біологічну релевантність. Одна зі сполук (Z1459912954) продемонструвала IC50 = 16,8 мкМ та була рекомендована для подальшої структурної оптимізації. Після виявлення активних хітів було виконано віртуальне подальше моделювання для розробки активніших та селективніших аналогів. Сформовано новий інтегрований робочий процес для комплексного вивчення особливостей сайту зв’язування з урахуванням методик FTMove, FTMap, а також залученням QSAR-моделювання з використанням алгоритмів машинного навчання. Окрему увагу приділено пошуку потенційних цинк-зв'язувальних сполук, здатних до координації з іоном Zn2+ у каталітичному центрі мішені. Реалізовано окремий докінг-напрямок, орієнтований на виявлення таких лігандів з бажаними координаційними властивостями. Сумарно в результаті виконаної роботи отримано 224 сполук-кандидатів, рекомендованих для подальшої біологічної валідації. Наукова новизна отриманих результатів полягає в застосуванні цілісного поєднання сучасних комп’ютерних (in silico) та експериментальних підходів, що дозволили реалізувати системний підхід до ідентифікації та валідації нових селективних інгібіторів АПФ2. Уперше реалізовано багаторівневу стратегію пошуку молекулярних зондів, яка поєднує докінг, фармакофорне моделювання, кластерний аналіз хемотипів, QSAR-моделювання з алгоритмами глибокого навчання, молекулярну динаміку, а також широкий спектр методів експериментальної перевірки (HTS-ферментативні аналізи, побудова кривих доза-відповідь). Запропоновано нові підходи до аналізу координаційної взаємодії лігандів з катіоном цинку у структурі мішені. Розроблені in silico моделі демонструють високу прогностичну здатність щодо селективності та афінності лігандів до АПФ2. Створено нові обчислювальні робочі процеси, які можуть бути використані для аналізу інших цинк-залежних ферментів. Отримано хімічні зонди з підтвердженою біологічною активністю та структурною новизною, три з яких подано на реєстрацію в Chemical Probe Portal. Практичне значення одержаних результатів визначається створенням та оптимізацією хімічних сполук, які можуть бути застосовані як високоякісні молекулярні зонди для фундаментальних досліджень ролі АПФ2 у фізіології та патології, зокрема та його роль в розповсюдженні та наслідках COVID-19. Розроблені підходи дозволяють проводити скринінг і оптимізацію лігандів для широкого спектра біологічних мішеней. Запропоновані методики можуть бути інтегровані в існуючі платформи комп’ютерного дизайну ліків, забезпечуючи швидкий перехід від первинного відбору до вдосконалення хітів та синтезу активних речовин у масштабах, придатних для біологічного тестування. Результати цієї роботи створюють основу для подальших розробок у сфері таргетної терапії та вивчення сигнальних шляхів, пов’язаних з АПФ2, що визначається можливістю створення нових інструментальних сполук — молекулярних зондів для фундаментального вивчення АПФ2. Запропоновані підходи можна застосовувати для дослідження інших біологічних мішеней і впровадження у сучасні платформи віртуального скринінгу та подальшої оптимізації активних сполук.Kravets I.O. Design and Discovery of Potential Inhibitors of Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2). — Qualification research manuscript. Dissertation for the degree of Doctor of Philosophy in the specialty 102 Chemistry (10 – Natural Sciences). — Institute of High Technologies, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, 2025. The dissertation is dedicated to the design and discovery of potential inhibitors of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). Within the scope of this research, the following objectives were accomplished: New chemotypes were identified among structurally related analogs of known inhibitors that demonstrated confirmed selective activity toward ACE2. Selected molecules were synthesized and characterized for further biological evaluation. Several known synthetic routes were optimized, and new efficient strategies were developed for the synthesis of key probe compounds. Process improvements significantly increased the yield of target compounds (up to tens of grams), reduced reagent costs, and simplified the hardware implementation of reactions. This was achieved by eliminating the use of expensive reagents, implementing more accessible laboratory equipment, and overall optimization of synthesis conditions. Two literature-described ACE2 inhibitors were synthesized in the required quantities using validated procedures. Three compounds were submitted for registration in the international Chemical Probe Portal (https://www.chemicalprobes.org/) as chemical probes — an authoritative resource for verifying molecular tools in biomedical research. A biochemical assay for ACE2 inhibitor screening was adapted by optimizing the use of the commercial kit from Abcam (ab273373). Reaction volumes and concentrations of key components (enzyme, substrate, inhibitor) were optimized, enabling reliable analytical signal detection even at reduced total reaction volumes (down to 25 µL). The method was validated by determining the IC₅₀ values of reference inhibitors (MLN-4760 and DX600) under newly established conditions. This enabled high-throughput screening (HTS) of 577 in silico selected compounds, followed by the construction of dose-response curves for confirmed active hits. New docking models for ACE2 and ACE were developed and validated. The resulting in silico models demonstrated high accuracy in predicting the activity of known ligands, allowing the assessment of binding selectivity between ACE2 and ACE for the purpose of designing a library of low-molecular-weight chemical probes for specific ACE2 inhibition. A high-throughput virtual screening approach was implemented with a focus on chemotype diversity. This strategy enabled efficient processing of molecular libraries containing up to 1.4 billion compounds, with high computational efficiency in terms of time and resources. Optimized protocols were proposed, achieving up to a tenfold reduction in computational costs by rationally combining fast pre-filtering steps with more accurate calculations. Virtual screening of the Enamine In-Stock collection was performed using three independently validated workflows. Selected complexes were further analyzed via molecular dynamics simulations to verify binding stability. Based on computational screening results, 577 compounds from the Enamine In-Stock collection were selected and tested in an experimental enzymatic assay using a fluorescent readout in HTS format. IC₅₀ values were determined for two reference compounds (Abcam reagent and EN300-22203532) — 185 nM and 0.9 nM, respectively. Seven new hits were identified that demonstrated inhibition levels above 30%. For these seven active compounds, dose-response curves (DRC) were constructed, confirming their biological relevance. One compound (Z1459912954) showed an IC₅₀ of 16.8 µM and was recommended for further structural optimization. Following the identification of active hits, virtual follow-up modeling was performed to develop more potent and selective analogs. A new integrated workflow was developed for comprehensive investigation of the binding site, incorporating FTMove and FTMap methodologies, as well as QSAR modeling using machine learning algorithms. Special attention was given to identifying potential zinc-binding compounds capable of coordinating with Zn²⁺ ions in the catalytic center of the target. A separate docking strategy was implemented to identify ligands with desired coordination properties. In total, 224 candidate compounds were obtained as a result of this work, recommended for further biological validation. Scientific novelty of the results lies in the application of a comprehensive combination of modern computational (in silico) and experimental approaches that enabled a systematic strategy for identifying and validating novel selective ACE2 inhibitors. For the first time, a multi-level strategy was implemented for the discovery of molecular probes, combining docking, pharmacophore modeling, chemotype-based cluster analysis, QSAR modeling with deep learning algorithms, molecular dynamics simulations, and a broad spectrum of experimental validation techniques (HTS enzymatic assays, dose-response curve construction). New approaches to analyzing ligand–zinc ion coordination within the target structure were proposed. The developed in silico models exhibit high predictive capability in assessing ligand selectivity and affinity for ACE2. New computational workflows were created that can be applied to the analysis of other zinc-dependent enzymes. Several chemical probes with confirmed biological activity and structural novelty were identified, three of which have been submitted for registration in the Chemical Probe Portal. Practical significance of the obtained results lies in the development and optimization of chemical compounds that can serve as high-quality molecular probes for fundamental research on the physiological and pathological roles of ACE2, including its involvement in the spread and consequences of COVID-19. The developed approaches enable ligand screening and optimization for a broad range of biological targets. The proposed methodologies can be integrated into existing drug design platforms, ensuring a rapid transition from initial hit selection to hit optimization and synthesis of active compounds at scales suitable for biological testing. The results of this study provide a foundation for future developments in targeted therapy and the investigation of ACE2-related signaling pathways, through the creation of novel instrumental compounds — molecular probes for fundamental ACE2 research. The proposed approaches can also be applied to the study of other biological targets and integrated into modern platforms for virtual screening and further optimization of active compounds.ukангіотензин-перетворювальний фермент 2 (АПФ2/ACE2)хімічні зондиорганічний синтезcovid-19молекулярний докінгin silico скринінгQSAR-моделюваннямолекулярна динамікамедична хіміяangiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)chemical probesorganic synthesisCOVID-19molecular dockingin silico screeningQSAR modelingmolecular dynamicsmedicinal chemistryДисертація