Метаболічний профіль фагоцитів у щурів з різними моделями хвороби Паркінсона
Дата
2023
Автори
Олійник Жанна Ігорівна
Назва журналу
ISSN журналу
Назва тому
Видавець
Анотація
Хвороба Паркінсона (ХП) – це друге за поширеністю нейродегенеративне захворювання з високим рівнем інвалідизації і смертності. Розрізняють спадкову та спорадичну (ідіопатичну) форми ХП. Спадкова форма захворювання складає біля 10% всіх його випадків, решту становить спорадична форма. Етіологія та патогенетичні механізми спорадичної форми ХП залишаються не до кінця вивченими. Згідно сучасної концепції, спорадична форма ХП розглядається як мультифакторне захворювання, основними (але не єдиними) патогенетичними механізмами якого є оксидативний стрес, пов’язаний з мітохондріальною дисфункцією, протеолітичний стрес, зумовлений дисфункцією убіквітинпротеасомної системи і місцеве запалення (нейрозапалення), які окремо або у поєднанні здатні викликати апоптоз дофамінергічних нейронів (ДН), що, у свою чергу, спричиняє розвиток моторних і немоторних симптомів хвороби.
Останнім часом особлива увага приділяється вивченню запалення у патогенезі ХП. У паренхімі головного мозку запальна реакція донедавна вважалася очевидним наслідком дегенерації нейронів, але останні спостереження вказують на прямий внесок запальних гліальних змін на ранній стадії захворювання. Крім того, системне запалення також впливає на розвиток дисфункції нейронів, створюючи порочне коло з локальним нейрозапаленням, що надає перебігу хвороби хронічного характеру.
На сьогоднішній день ХП залишається невиліковним захворюванням, а існуюча терапія – симптоматичною. Розуміння механізмів патогенезу може дозволити ідентифікувати нові терапевтичні цілі та розробити патогенетичне лікування хвороби. Розшифрування механізмів патогенезу і розробка патогенетичних методів лікування передбачають використання тваринних моделей.
Гетерогенність хвороби вимагає використання різних моделей, оскільки жодна численних існуючих не відтворює всі її особливості. Для дослідження запалення у структурі патогенезу ХП розроблено тваринні моделі, засновані на інтрацеребральному та системному введенні інфламогенів. Серед них найчастіше застосовуються моделі на основі інтрацеребрального введення 6гідроксидофаміну (6OHDA) та бактеріального ліпополісахариду (ЛПС). Однак, порівняння релевантності цих моделей щодо відтворення всіх аспектів локального і системного запалення, притаманного клінічному перебігу ХП, у літературі відсутнє.
Ключовими ефекторними клітинами локальних і системних запальних процесів є фагоцити (макрофаги, моноцити і нейтрофіли), які виконують як роль ініціаторів запальних процесів, так і функцію гальмування (резолюції) запалення. Оцінка функціонального профілю фагоцитів дозволяє охарактеризувати виразність і стадію запального процесу, а також взаємозв’язок між локальним і системним запаленням.
З огляду на вище зазначене метою роботи було провести порівняльну оцінку метаболічного профілю тканинних резидентних та циркулюючих фагоцитів у щурів з моделями ХП, які найчастіше використовуються для дослідження запалення: індуковані інтрацеребральним уведенням 6OHDA та ЛПС.
Розвиток симптомів захворювання констатували за результатами оцінки загибелі ДН в апоморфіновому тесті та імуногістохімічного дослідження тирозинової гідроксилази (яка є маркером цих нейронів), а також за результатами поведінкового тесту «Відкрите поле». Метаболічний профіль (прота протизапальний) фагоцитів характеризували за результатами оцінки їх оксидативного метаболізму (генерації реактивних форм кисню), фагоцитарної активності та експресії фенотипових маркерів CD80/86 (костимуляторні молекули, залучені в антигенпрезентацію, маркер прозапальної поляризованої активації) та CD206 (член родини рецепторів ендоцитозу, маркер протизапальної поляризованої активації фагоцитів), які досліджували методом проточної цитометрії. Для підтвердження наявності локального і системного запальних процесів додатково досліджували загально визнані їх характеристики: маркери реактивного астрогліозу, концентрацію Среактивного білка у плазмі крові, інтегральні індекси системного запалення, засновані на співвідношенні кількісних показників лейкоцитів різних популяцій за результатами гемограми, вагові показники та клітинність лімфоїдних органів. Дослідження метаболічного профілю фагоцитів різної локалізації (мікрогліальних клітин, моноцитів і нейтрофілів периферичної крові, перитонеальних макрофагів) та інші вище зазначені показники досліджували на 28 добу з моменту ініціювання захворювання, що дозволяло виявити хронічні запальні процеси.
Порівняльна оцінка критеріїв розвитку ХП у тварин з різними моделями виявила більший ступінь втрати ДН у щурів з 6OHDAХП порівняно з тваринами з ЛПСіндукованою хворобою (~90% проти ~60%), що було засвідчено результатами апоморфінового тесту та імуногістохімічного аналізу експресії тирозинової гідроксилази у чорній субстанції. Моторні і немоторні симптоми хвороби, які оцінювали у поведінковому тесті «Відкрите поле», були порівняними у тварин з обома моделями: зменшення загальної пройденої дистанції, подовження латентного періоду до початку рухової активності, зменшення кількості вертикальних підйомів, актів грумінгу та дефекації. Отримані результати вказують на те, що моторні порушення у моделі 6OHDAХП викликані безпосередньо загибеллю ДН внаслідок активації апоптозу токсином. У той час, як моторні і немоторні симптоми у щурів з ЛПСХП зумовлені більшою мірою нейрозапаленням, спричиненим бактеріальним ендотоксином, що засвідчили результати порівняльної оцінки метаболічного профілю мікрогліальних клітин у тварин з різними моделями.
Порівняльна оцінка фенотипових і функціональних характеристик клітин мікроглії виявила їх відмінності у щурів з 6OHDAта ЛПСіндукованою ХП. Відсутність функціонального резерву оксидативного метаболізму (що вказує на його персистентну активацію та/або метаболічне виснаження клітини в результаті тривалої запальної активації) та значно підвищена частка клітин, що експресують костимуляторні молекули CD80/86 у складі мікроглії у тварин з ЛПСХП вказують на їх прозапальний метаболічний зсув, на відміну від протизапального фенотипу мікроглії щурів з 6OHDAХП, засвідченого підвищенням відсотка клітин з експресією маркера протизапального метаболічного зсуву CD206 одночасно зі зниженням частки CD80/86позитивних клітин. Такі результати вказують на те, що тривале нейрозапалення на 28 добу після ініціювання хвороби зберігається лише у моделі, індукованій інтрацеребральним уведенням ЛПС. Метаболічний профіль циркулюючих фагоцитів у тварин з ЛПСХП також характеризувався прозапальною спрямованістю: збільшенням показника оксидативного мтеаболізму у 5 разів порівняно з контролем, істотним зниженням фагоцитарної активності, збільшенням вдвічі частки CD80/86позитивних клітин.
Прозапальний метаболічний зсув фагоцитів периферичної крові у тварин з цією моделлю був асоційований з нейтрофільозом і підвищеними, порівняно з контролем, значеннями інтегральних індексів системного запалення (нейтрофільнолімфоцитарного коефіцієнта, тромбоцитарнолімфоцитарного коефіцієнта та індекса системного імунного запалення). Циркулюючі фагоцити щурів з 6OHDAХП вирізнялися протизапальною поляризованою активацією зі зниженням генерації реактивних форм кисню, посиленням фагоцитарної активності, зниженням експресії фенотипового маркера CD80/86 і підвищенням частки клітин з експресією CD206. Протизапальний метаболічний зсув циркулюючих фагоцитів у тварин з цією моделлю супроводжувався зниженням відносної кількості нейтрофілів та значень інтегральних індексів системного запалення порівняно з аналогічними показниками тварин контрольних груп. У сукупності отримані нами дані вперше демонструють наявність системного запального процесу у віддалені терміни після ініціювання ХП введенням токсину лише в ЛПСіндукованій моделі. У той час, як показники метаболічного профілю циркулюючих фагоцитів та інші біомаркери системного запалення у щурів з 6OHDAХП вказують на гальмування (резолюцію) системного запалення у цьому ж часовому проміжку.
Кореляційний аналіз залежності між метаболічними характеристиками мікрогліальних клітин та значеннями інтегральних індексів системного запалення виявив сильний позитивний зв’язок між часткою CD80/86позитивних мікрогліальних клітин та нейтрофільнолімфоцитарним коефіцієнтом, тромбоцитарнолімфоцитарним коефіцієнтом, а також індексом системного імунного запалення у щурів з ЛПСХП, що вперше доводить причиннонаслідковий зв’язок між поляризованою активацією фагоцитів головного мозку і розвитком системного запалення, а також демонструє відтворення на моделі ЛПСХП порочного кола запалення, притаманного клінічному перебігу хвороби. У щурів з OHDAіндукованою моделлю ХП зареєстровано помірний негативний кореляційний зв’язок між часткою CD80/86позитивних мікрогліальних клітин і нейтрофільнолімфоцитарним коефіцієнтом та також індексом системного імунного запалення, що може пояснюватися подвійною роллю молекул членів родини В7, до складу якої входять CD80 (В7.1) і CD86 (В7.2), у регуляції імунної відповіді. Надекспресія В7.1 властива одночасно імуностимуляторним мієлоїдним клітинам з антигенпрезентувальною здатністю та мієлоїдним суп ресорним клітинам (MyeloidDerived Suppressor Cells, MDSC). Як зазначено вище, мікроглія тварин з OHDAХП вирізнялася підвищеною часткою клітин, що експресують CD206 – маркер, що притаманний фагоцитам протизапального метаболічного профілю, а також CD80позитивним MDSC. Зважаючи на це негативний кореляційний зв’язок між часткою CD80/86позитивних клітин мікроглії та значеннями інтегральних індексів системного запалення у тварин з OHDAХП може вказувати на імуносупресорний фенотип фагоцитів мікроглії, функції яких пов’язані з гальмуванням (резолюцією) запалення.
Уперше зареєстровано відмінності у метаболічному профілі перитонеальних макрофагів (ПМ) у щурів з різними моделями ХП. ПМ структурно пов’язані з лімфоїдними кластерами, асоційованими з жировою тканиною (FatAssociated Lymphoid Clasters, FALC), функцію яких у черевній порожнині виконують так звані «молочні плями» (Milky Spots) лімфоїдної тканини, асоційованої із сальником (OmentumAssociated Lymphoid Tissue). У стані спокою ПМ характеризуються зсувом метаболізму у бік протизапального М2фенотипу і відіграють важливу роль у резолюції будьякого запального процесу, що стосується органів черевної порожнини, у т.ч. кишечника, хронічне запалення якого розглядається як важливий компонент патофізіології ХП. За результатами наших досліджень у щурів з 6OHDAХП ПМ характеризувалися збільшенням фагоцитарного індексу в 1,9 раза, посиленням експресії CD206 в 1,4 раза і зниженням експресії CD80/86 вдвічі порівняно з аналогічними показниками тварин контрольних груп, що свідчить про їх протизапальний метаболічний профіль. ПМ тварин з ЛПСХП мали підвищений у півтора рази порівняно з контролем рівень експресії CD80/86, що вказує на їх прозапальний метаболічний зсув.
Таким чином, за результатами порівняльної оцінки метаболічного профілю фагоцитів різної локалізації у тварин з різними моделями ХП показано, що прозапальні метаболічні і фенотипові характеристики мікроглії, моноцитів і нейтрофілів периферичної крові, ПМ, а також існування позитивного кореляційного зв’язку між метаболічними характеристиками фагоцитів мікроглії та індексами системного запалення у тварин з ЛПСіндукованою моделлю переконливо доводять її релевантність щодо відтворення локального нейрозапалення, системного запалення та їх взаємозв’язку, яківластивіклінічному перебігу спорадичної форми захворювання. Результати роботи експериментально обґрунтовують адекватність ЛПСіндукованої моделі ХП для дослідження механізмів запалення у структурі патогенезу ХП, а також для доклінічної оцінки ефективності протизапальних препаратів у комплексній терапії захворювання. Показники метаболічного профілю фагоцитів різної локалізації можуть бути використані як інформативні маркери локального і системного запалення у таких дослідженнях.
Ключові слова: хвороба Паркінсона, 6OHDA, ліпополісахарид, запалення, фагоцити, мікроглія, макрофаги, моноцити, нейтрофіли, реактивні форми кисню, фагоцитоз.
Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease with a high level of disability and mortality. There are hereditary and sporadic (idiopathic) forms of PD. The hereditary form of the disease accounts for about 10% of all its cases, the rest is a sporadic form. The etiology and pathogenetic mechanisms of the sporadic form of PD remain incompletely understood. According to the current concept, the sporadic form of PD is considered a multifactorial disease, the main (but not the only) pathogenetic mechanisms of which are oxidative stress associated with mitochondrial dysfunction, proteolytic stress due to dysfunction of the ubiquitinproteasome system, and local inflammation (neuroinflammation), which individually or in combination can cause apoptosis of dopaminergic neurons (DN), and, as a result, the development of motor and nonmotor symptoms of the disease. Recently, special attention has been paid to the study of inflammation in the pathogenesis of PD. In the brain parenchyma, the inflammatory response was until recently considered an obvious consequence of neuronal degeneration, but recent observations indicate a direct contribution of inflammatory glial changes in the early stage of the disease. In addition, systemic inflammation also affects the development of neuronal dysfunction, creating a vicious circle with local neuroinflammation, which gives the disease a chronic course. To date, PD remains an incurable disease, and the existing therapy is symptomatic. Understanding the mechanisms of pathogenesis may allow the identification of new therapeutic targets and the development of disease modifying treatment modalities. Deciphering the mechanisms of pathogenesis and developing pathogenetic treatment methods involve the use of animal models. The heterogeneity of the disease requires the use of different models, since none of the numerous existing ones reproduces all its features. To study inflammation in the structure of the PD pathogenesis, animal models based on intracerebral and systemic administration of inflammagens have been developed. Among them, models based on intracerebral administration of 610 hydroxydopamine (6OHDA) and bacterial lipopolysaccharide (LPS) are most often used. However, a comparison of the relevance of these models in reproducing all aspects of local and systemic inflammation inherent in the clinical course of PD is absent in the literature. The key effector cells of local and systemic inflammatory processes are phagocytes (macrophages, monocytes, and neutrophils), which perform both the role of initiators of inflammatory processes and the function of inhibition (resolution) of inflammation. Assessing functional profile of phagocytes allows to characterize the severity and stage of the inflammatory process, as well as the functional link between local and systemic inflammation. In view of the above, the aim of the work was to conduct a comparative assessment of the metabolic profile of tissue resident and circulating phagocytes in rats with PD models, which are most often used to study inflammation: induced by intracerebral administration of 6OHDA and LPS. The development of symptoms of the disease was determined by the results of the assessment of the DN loss by the results of the apomorphine test and by the immunohistochemical assay of tyrosine hydroxylase (which is a marker of these neurons), as well as by the results of the "Open field" behavioral test. The metabolic profile (proand antiinflammatory) of phagocytes was characterized based on the results of the assessment of their oxidative metabolism (generation of reactive oxygen species), phagocytic activity and expression of the phenotypic markers CD80/86 (costimulatory molecules involved in antigen presentation, phenotypic marker of proinflammatory phagocyte profile) and CD206 (the member of a family of endocytic receptors, phenotypic marker of antiinflammatory phagocyte profile), which were determined by flow cytometry. In order to confirm the presence of local and systemic inflammatory processes, their generally recognized characteristics were additionally investigated: markers of reactive astrogliosis, concentration of Creactive protein in blood plasma, integral systemic inflammation indices, which were calculated as the ratio of absolute counts of leukocytes of different populations according to the results of a hemogram analysis, weight indexes and cellularity of lymphoid organs (thymus and spleen). The study of the metabolic profile of phagocytes of different localization (microglial cells, monocytes and neutrophils of peripheral blood, peritoneal macrophages) and other abovementioned indicators were studied on the 28th day after the disease initiation, which made it possible to observe and reveal chronic inflammatory processes. Comparative evaluation of the criteria for the PD development in animals with different models revealed a greater degree of DN loss in rats with 6OHDAPD compared to animals with LPSinduced disease (~90% vs. ~60%), which was evidenced by the results of the apomorphine test and by the tyrosine hydroxylase immunostaining in the substantia nigra. Motor and nonmotor symptoms of the disease, which were evaluated in the behavioral test "Open field", were comparable in animals with both models. In 6OHDAand LPSlesioned rats we have registered a decrease in the total distance traveled, increased latency to start the movement, a decrease in the number of rearing, grooming and defecation. It suggests that behavioral abnormalities in 6OHDAlesioned rats may be primarily stipulated by DN damage as a result of selective toxic effect of 6OHDA, whereas motor and nonmotor symptoms in LPSlesioned animals may be foremost associated with more pronounced proinflammatory activation of the microglia cell population, which was indicated by the results of comparative assessment of metabolic profiles of these cells. Comparative assessment of phenotypic and functional characteristics of microglial cells revealed their differences in rats with 6OHDAand LPSinduced PD. The lack of a functional reserve of oxidative metabolism (which indicates its persistent activation and/or metabolic cell exhaustion caused by prolonged proinflammatory activation) and increased proportion of cells expressing costimulatory molecules CD80/86 in the complex microglia population of animals with LPSPD indicate their proinflammatory metabolic profile, unlike from the antiinflammatory phenotype of microglia of rats with 6OHDAPD, evidenced by an increase in the percentage of cells expressing the antiinflammatory metabolic shift marker CD206, along with a decrease in the proportion of CD80/86positive cells. Such results indicate that longterm neuroinflammation persists only in the model induced by intracerebral LPS administration. The metabolic profile of circulating phagocytes in animals with LPSPD was also characterized by a proinflammatory orientation as was evidenced by a 5fold increase in the index of oxidative metabolism compared to the control, a significant decrease in phagocytic activity, and a doubling of the proportion of CD80/86positive cells. The proinflammatory metabolic shift of peripheral blood phagocytes in animals with this model was associated with neutrophilia and increased values of integral indices of systemic inflammation (NeutrophiltoLymphocyte Ratio, PlatelettoLymphocyte ratio and Index of Systemic Immune Inflammation) as compared to controls. Circulating phagocytes of rats with 6OHDAPD were distinguished by antiinflammatory polarized activation with a decrease in reactive oxygen species generation, an increase in phagocytic activity, a decrease in the expression of the phenotypic marker CD80/86, and an increase in the proportion of cells expressing the CD206. The antiinflammatory metabolic shift of circulating phagocytes in animals with this model was accompanied by a decrease in the relative number of neutrophils and values of integral indices of systemic inflammation compared to similar indicators of animals in the control groups. Collectively, our findings demonstrate for the first time the presence of a systemic inflammatory process in the distant term after the initiation of PD by the introduction of a toxin only in the LPSinduced model. While metabolic profile indicators of circulating phagocytes and other biomarkers of systemic inflammation in rats with 6OHDAPD mirror inhibition (resolution) of systemic inflammation in the same time period. Correlation analysis of the dependence between the metabolic characteristics of microglial cells and the values of integral indices of systemic inflammation revealed a strong positive relationship between the proportion of CD80/86positive microglial cells and the NeutrophiltoLymphocyte ratio, the PlatelettoLymphocyte ratio, as well as the Systemic Immune Inflammation Index in rats with LPSPD, which for the first time proves a causeandeffect relationship between the polarized activation of brain phagocytes and the development of systemic inflammation, and also demonstrates the reproduction of the vicious cycle of inflammation inherent in the clinical course of the disease in the LPSPD model. In rats with the OHDAinduced model of PD, a moderate negative correlation was registered between the proportion of CD80/86positive microglial cells and the NeutrophiltoLymphocyte ratio, as well as the Systemic Immune Inflammation Index, which can be explained by the dual role of molecules members of the B7 family, which include CD80 (B7.1) and CD86 (B7.2), in the regulation of the immune response. Overexpression of B7.1 is characteristic of both immunostimulatory myeloid cells with antigenpresenting ability and myeloidderived suppressor cells (MDSC). It is necessary to point that CD80 overexpressing MDSC are CD206positive. Considering the increase of CD206positive cell fraction in microglia of rats with OHDAPD, one can suppose, that the negative correlation between the proportion of CD80/86positive microglial cells and the values of integral indices of systemic inflammation may indicate the immunosuppressive phenotype of these phagocytes, whose functions are related to the inhibition (resolution) of inflammation. Differences in the metabolic profile of peritoneal macrophages (PM) in rats with different PD models were reported for the first time. PMs are structurally related to fatassociated lymphoid clusters (FALC), whose function in the peritoneal cavity is performed by the socalled "milky spots" of OmentumAssociated Lymphoid Tissue. In resting state, PM are characterized by a shift of metabolism towards the antiinflammatory M2 phenotype and play an important role in the resolution of any inflammatory process affecting the organs of the peritoneal cavity, including intestine, chronic inflammation of which is considered an important component of the PD pathophysiology. According to our findings, in rats with 6OHDAPD, PM were characterized by a 1.9fold increase in the phagocytic index, a 1.4fold increase in the expression of CD206, and a 2fold decrease in the expression of CD80/86 compared to the similar indicators of the animals of the control groups, which indicates their antiinflammatory metabolic profile. In the PM of animals with LPSPD, one and a half times higher expression level of CD80/86 compared to control animals was observed, indicating their proinflammatory metabolic shift. Thus, according to the results of a comparative assessment of the metabolic profile of phagocytes of different localization in animals with different PD models, it is shown that proinflammatory metabolic and phenotypic characteristics of microglia, monocytes and neutrophils of peripheral blood, PM, as well as the existence of a positive correlation between the metabolic characteristics of microglia phagocytes and indices of systemic inflammation in animals with the LPSinduced model convincingly prove its relevance for the reproduction of local neuroinflammation, systemic inflammation and their interrelation, which are characteristic of the clinical course of the sporadic disease form. The results of the work experimentally substantiate the adequacy of the LPSinduced PD model for the study of the mechanisms of inflammation in the complex PD pathogenesis, as well as for the preclinical assessment of the effectiveness of antiinflammatory drugs in the complex therapy of the disease. Indicators of the metabolic profile of phagocytes of different localization can be used as informative markers of local and systemic inflammation in such studies. Key words: Parkinson's disease, 6OHDA, lipopolysaccharide, inflammation, phagocytes, microglia, macrophages, monocytes, neutrophils, reactive oxygen species, phagocytosis.
Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease with a high level of disability and mortality. There are hereditary and sporadic (idiopathic) forms of PD. The hereditary form of the disease accounts for about 10% of all its cases, the rest is a sporadic form. The etiology and pathogenetic mechanisms of the sporadic form of PD remain incompletely understood. According to the current concept, the sporadic form of PD is considered a multifactorial disease, the main (but not the only) pathogenetic mechanisms of which are oxidative stress associated with mitochondrial dysfunction, proteolytic stress due to dysfunction of the ubiquitinproteasome system, and local inflammation (neuroinflammation), which individually or in combination can cause apoptosis of dopaminergic neurons (DN), and, as a result, the development of motor and nonmotor symptoms of the disease. Recently, special attention has been paid to the study of inflammation in the pathogenesis of PD. In the brain parenchyma, the inflammatory response was until recently considered an obvious consequence of neuronal degeneration, but recent observations indicate a direct contribution of inflammatory glial changes in the early stage of the disease. In addition, systemic inflammation also affects the development of neuronal dysfunction, creating a vicious circle with local neuroinflammation, which gives the disease a chronic course. To date, PD remains an incurable disease, and the existing therapy is symptomatic. Understanding the mechanisms of pathogenesis may allow the identification of new therapeutic targets and the development of disease modifying treatment modalities. Deciphering the mechanisms of pathogenesis and developing pathogenetic treatment methods involve the use of animal models. The heterogeneity of the disease requires the use of different models, since none of the numerous existing ones reproduces all its features. To study inflammation in the structure of the PD pathogenesis, animal models based on intracerebral and systemic administration of inflammagens have been developed. Among them, models based on intracerebral administration of 610 hydroxydopamine (6OHDA) and bacterial lipopolysaccharide (LPS) are most often used. However, a comparison of the relevance of these models in reproducing all aspects of local and systemic inflammation inherent in the clinical course of PD is absent in the literature. The key effector cells of local and systemic inflammatory processes are phagocytes (macrophages, monocytes, and neutrophils), which perform both the role of initiators of inflammatory processes and the function of inhibition (resolution) of inflammation. Assessing functional profile of phagocytes allows to characterize the severity and stage of the inflammatory process, as well as the functional link between local and systemic inflammation. In view of the above, the aim of the work was to conduct a comparative assessment of the metabolic profile of tissue resident and circulating phagocytes in rats with PD models, which are most often used to study inflammation: induced by intracerebral administration of 6OHDA and LPS. The development of symptoms of the disease was determined by the results of the assessment of the DN loss by the results of the apomorphine test and by the immunohistochemical assay of tyrosine hydroxylase (which is a marker of these neurons), as well as by the results of the "Open field" behavioral test. The metabolic profile (proand antiinflammatory) of phagocytes was characterized based on the results of the assessment of their oxidative metabolism (generation of reactive oxygen species), phagocytic activity and expression of the phenotypic markers CD80/86 (costimulatory molecules involved in antigen presentation, phenotypic marker of proinflammatory phagocyte profile) and CD206 (the member of a family of endocytic receptors, phenotypic marker of antiinflammatory phagocyte profile), which were determined by flow cytometry. In order to confirm the presence of local and systemic inflammatory processes, their generally recognized characteristics were additionally investigated: markers of reactive astrogliosis, concentration of Creactive protein in blood plasma, integral systemic inflammation indices, which were calculated as the ratio of absolute counts of leukocytes of different populations according to the results of a hemogram analysis, weight indexes and cellularity of lymphoid organs (thymus and spleen). The study of the metabolic profile of phagocytes of different localization (microglial cells, monocytes and neutrophils of peripheral blood, peritoneal macrophages) and other abovementioned indicators were studied on the 28th day after the disease initiation, which made it possible to observe and reveal chronic inflammatory processes. Comparative evaluation of the criteria for the PD development in animals with different models revealed a greater degree of DN loss in rats with 6OHDAPD compared to animals with LPSinduced disease (~90% vs. ~60%), which was evidenced by the results of the apomorphine test and by the tyrosine hydroxylase immunostaining in the substantia nigra. Motor and nonmotor symptoms of the disease, which were evaluated in the behavioral test "Open field", were comparable in animals with both models. In 6OHDAand LPSlesioned rats we have registered a decrease in the total distance traveled, increased latency to start the movement, a decrease in the number of rearing, grooming and defecation. It suggests that behavioral abnormalities in 6OHDAlesioned rats may be primarily stipulated by DN damage as a result of selective toxic effect of 6OHDA, whereas motor and nonmotor symptoms in LPSlesioned animals may be foremost associated with more pronounced proinflammatory activation of the microglia cell population, which was indicated by the results of comparative assessment of metabolic profiles of these cells. Comparative assessment of phenotypic and functional characteristics of microglial cells revealed their differences in rats with 6OHDAand LPSinduced PD. The lack of a functional reserve of oxidative metabolism (which indicates its persistent activation and/or metabolic cell exhaustion caused by prolonged proinflammatory activation) and increased proportion of cells expressing costimulatory molecules CD80/86 in the complex microglia population of animals with LPSPD indicate their proinflammatory metabolic profile, unlike from the antiinflammatory phenotype of microglia of rats with 6OHDAPD, evidenced by an increase in the percentage of cells expressing the antiinflammatory metabolic shift marker CD206, along with a decrease in the proportion of CD80/86positive cells. Such results indicate that longterm neuroinflammation persists only in the model induced by intracerebral LPS administration. The metabolic profile of circulating phagocytes in animals with LPSPD was also characterized by a proinflammatory orientation as was evidenced by a 5fold increase in the index of oxidative metabolism compared to the control, a significant decrease in phagocytic activity, and a doubling of the proportion of CD80/86positive cells. The proinflammatory metabolic shift of peripheral blood phagocytes in animals with this model was associated with neutrophilia and increased values of integral indices of systemic inflammation (NeutrophiltoLymphocyte Ratio, PlatelettoLymphocyte ratio and Index of Systemic Immune Inflammation) as compared to controls. Circulating phagocytes of rats with 6OHDAPD were distinguished by antiinflammatory polarized activation with a decrease in reactive oxygen species generation, an increase in phagocytic activity, a decrease in the expression of the phenotypic marker CD80/86, and an increase in the proportion of cells expressing the CD206. The antiinflammatory metabolic shift of circulating phagocytes in animals with this model was accompanied by a decrease in the relative number of neutrophils and values of integral indices of systemic inflammation compared to similar indicators of animals in the control groups. Collectively, our findings demonstrate for the first time the presence of a systemic inflammatory process in the distant term after the initiation of PD by the introduction of a toxin only in the LPSinduced model. While metabolic profile indicators of circulating phagocytes and other biomarkers of systemic inflammation in rats with 6OHDAPD mirror inhibition (resolution) of systemic inflammation in the same time period. Correlation analysis of the dependence between the metabolic characteristics of microglial cells and the values of integral indices of systemic inflammation revealed a strong positive relationship between the proportion of CD80/86positive microglial cells and the NeutrophiltoLymphocyte ratio, the PlatelettoLymphocyte ratio, as well as the Systemic Immune Inflammation Index in rats with LPSPD, which for the first time proves a causeandeffect relationship between the polarized activation of brain phagocytes and the development of systemic inflammation, and also demonstrates the reproduction of the vicious cycle of inflammation inherent in the clinical course of the disease in the LPSPD model. In rats with the OHDAinduced model of PD, a moderate negative correlation was registered between the proportion of CD80/86positive microglial cells and the NeutrophiltoLymphocyte ratio, as well as the Systemic Immune Inflammation Index, which can be explained by the dual role of molecules members of the B7 family, which include CD80 (B7.1) and CD86 (B7.2), in the regulation of the immune response. Overexpression of B7.1 is characteristic of both immunostimulatory myeloid cells with antigenpresenting ability and myeloidderived suppressor cells (MDSC). It is necessary to point that CD80 overexpressing MDSC are CD206positive. Considering the increase of CD206positive cell fraction in microglia of rats with OHDAPD, one can suppose, that the negative correlation between the proportion of CD80/86positive microglial cells and the values of integral indices of systemic inflammation may indicate the immunosuppressive phenotype of these phagocytes, whose functions are related to the inhibition (resolution) of inflammation. Differences in the metabolic profile of peritoneal macrophages (PM) in rats with different PD models were reported for the first time. PMs are structurally related to fatassociated lymphoid clusters (FALC), whose function in the peritoneal cavity is performed by the socalled "milky spots" of OmentumAssociated Lymphoid Tissue. In resting state, PM are characterized by a shift of metabolism towards the antiinflammatory M2 phenotype and play an important role in the resolution of any inflammatory process affecting the organs of the peritoneal cavity, including intestine, chronic inflammation of which is considered an important component of the PD pathophysiology. According to our findings, in rats with 6OHDAPD, PM were characterized by a 1.9fold increase in the phagocytic index, a 1.4fold increase in the expression of CD206, and a 2fold decrease in the expression of CD80/86 compared to the similar indicators of the animals of the control groups, which indicates their antiinflammatory metabolic profile. In the PM of animals with LPSPD, one and a half times higher expression level of CD80/86 compared to control animals was observed, indicating their proinflammatory metabolic shift. Thus, according to the results of a comparative assessment of the metabolic profile of phagocytes of different localization in animals with different PD models, it is shown that proinflammatory metabolic and phenotypic characteristics of microglia, monocytes and neutrophils of peripheral blood, PM, as well as the existence of a positive correlation between the metabolic characteristics of microglia phagocytes and indices of systemic inflammation in animals with the LPSinduced model convincingly prove its relevance for the reproduction of local neuroinflammation, systemic inflammation and their interrelation, which are characteristic of the clinical course of the sporadic disease form. The results of the work experimentally substantiate the adequacy of the LPSinduced PD model for the study of the mechanisms of inflammation in the complex PD pathogenesis, as well as for the preclinical assessment of the effectiveness of antiinflammatory drugs in the complex therapy of the disease. Indicators of the metabolic profile of phagocytes of different localization can be used as informative markers of local and systemic inflammation in such studies. Key words: Parkinson's disease, 6OHDA, lipopolysaccharide, inflammation, phagocytes, microglia, macrophages, monocytes, neutrophils, reactive oxygen species, phagocytosis.
Бібліографічний опис
Галузь знань та спеціальність
09 Біологія , 091 Біологія та біохімія
Бібліографічний опис
Олійник Ж. І. Метаболічний профіль фагоцитів у щурів з різними моделями хвороби Паркінсона : дис. … д-ра філософії : 091Біологія / Олійник Жанна Ігорівна. - Київ, 2023. - 163 с.