Адаптація CRISPR-Cas системи IV типу для редагування геному в еукаріотичних клітинах
Дата
2023
Автори
Пономарьова Дарія Сергіївна
Назва журналу
ISSN журналу
Назва тому
Видавець
Анотація
В ході даного дослідження було додатково вивчено систему CRISPR-Cas IV типу, створено вектор для встановлення функціонування цієї системи в еукаріотичних клітинах. Гени CRISPR-Cas системи типу IV, оптимізовані для еукаріотичної експресії та містячі послідовності NLS і послідовності саморозщеплюваних пептидів 2A, а також мітки, клоновані в плазміду, були отримані за допомогою таких методів, як дизайн плазміди в програмному забезпеченні Benchling, ПЛР та клонування Golden Gate.
Також було сконструйовано мінімальні системи CRISPR-Cas, розроблено метод визначення активності систем CRISPR-Cas IV типу.Метою дослідження було створення системи для використання CRISPR-Cas IV типу для редагування геному в еукаріотичних клітинах. Можливості використання редагування CRISPR in vivo обмежуються, частково, через обмежену місткість AAV векторів, які є важливою платформою доставки редакторів геному в еукаріотичні клітини. Цю проблему потенційно можна вирішити за допомогою адаптації компактних редакторів геному, таких як CRISPR-Cas IV типу (3,2 кб).
Метою роботи також було дослідження можливостей додатковї мінімізації систем CRISPR-Cas IV типу за рахунок видалення білка Cas6e, оскільки коли зрілі crRNA одиничного розміру забезпечуються незалежним від Cas6e шляхом термінації транскрипції, система CRISPR-Cas потенційно може функціонувати без Cas6e. Систему також можна мінімізувати шляхом виключення білка DinG та адаптації системи для епігенетичного використання.
Такі методи, як конструювання плазмід, ПЛР, збірка Golden Gate, використовувалися під час цього дослідження для створення еукаріотичної системи експресії для експресії білків типу IV у еукаріотичних клітинах, а також для створення векторів для експресії функціонального мінімального типу системи IV, і, нарешті, для створення методу визначення активності системи IV типу.
Ключові слова: CRISPR-Cas, class 1 CRISPR, редагування еукаріотичного геному.
In this study, my goal was to improve the understanding of type IV CRISPR Cas systems, since not all mechanisms of action and biological functions of type IV systems are known, type IV CRISPR-Cas systems are the least studied of the six known types of CRISPR-Cas. The aim of the study was also to create a system for using CRISPR-Cas type IV for genome editing in eukaryotic cells. The possibilities of using CRISPR editing in vivo are limited, in part, by the limited capacity of AAV vectors, which are an important platform for the delivery of genome editors into eukaryotic cells. This problem can potentially be solved by adapting compact genome editors such as CRISPR-Cas type IV (3.2 kb). The goal of the work was also to investigate the possibilities of additional minimization of CRISPR-Cas systems of type IV by removing the Cas6e protein, since when mature single-sized crRNAs are provided in a Cas6e-independent manner by transcription termination, the CRISPR-Cas system can potentially function without Cas6e. The system can also be minimized by excluding the DinG protein and adapting the system for epigenetic use. Techniques such as plasmid construction, PCR, Golden Gate assembly were used in this study to create a eukaryotic expression system to express type IV proteins in eukaryotic cells, and to create vectors to express a functional minimal type IV system, and finally to creation of a method for determining the activity of a type IV system. Keywords: CRISPR-Cas, class 1 CRISPR, eukaryotic genome editing
In this study, my goal was to improve the understanding of type IV CRISPR Cas systems, since not all mechanisms of action and biological functions of type IV systems are known, type IV CRISPR-Cas systems are the least studied of the six known types of CRISPR-Cas. The aim of the study was also to create a system for using CRISPR-Cas type IV for genome editing in eukaryotic cells. The possibilities of using CRISPR editing in vivo are limited, in part, by the limited capacity of AAV vectors, which are an important platform for the delivery of genome editors into eukaryotic cells. This problem can potentially be solved by adapting compact genome editors such as CRISPR-Cas type IV (3.2 kb). The goal of the work was also to investigate the possibilities of additional minimization of CRISPR-Cas systems of type IV by removing the Cas6e protein, since when mature single-sized crRNAs are provided in a Cas6e-independent manner by transcription termination, the CRISPR-Cas system can potentially function without Cas6e. The system can also be minimized by excluding the DinG protein and adapting the system for epigenetic use. Techniques such as plasmid construction, PCR, Golden Gate assembly were used in this study to create a eukaryotic expression system to express type IV proteins in eukaryotic cells, and to create vectors to express a functional minimal type IV system, and finally to creation of a method for determining the activity of a type IV system. Keywords: CRISPR-Cas, class 1 CRISPR, eukaryotic genome editing
Бібліографічний опис
Галузь знань та спеціальність
16 Хімічна інженерія та біоінженерія , 162 Біотехнології та біоінженерія
Бібліографічний опис
Пономарьова Д. С. Адаптація CRISPR-Cas системи IV типу для редагування геному в еукаріотичних клітинах : випускна кваліфікаційна робота магістра : 162 Біотехнологія та біоінженерія / Пономарьова Дарія Сергіївна. - Київ, 2023. - 58 с.